公益中国爱心救助定点医院 http://disease.39.net/yldt/bjzkbdfyy/6108180.html 基于网络药理学和分子对接技术探讨生脉注射液抗新型冠状病*肺炎的作用机制 -09-13
导读
2型糖尿病（T2D）可引起多种并发症，包括认知衰退等神经疾病。间歇性禁食（IF）是一种周期性的禁食方法，可有效改善代谢和减轻胰岛素抵抗等T2D症状，在一些动物模型中也显示出神经保护和改善认知的作用，但IF对T2D相关认知损伤的影响仍不清楚。NatureCommunications上发表了题为“肠道菌群介导的间歇性禁食减轻糖尿病引起的认知损伤”的文章，通过多组学技术（肠道菌群、血浆代谢组、大脑转录组）结合行为测试等方法综合分析了IF对T2D小鼠认知损伤的影响和相关机制，研究表明IF引起的小鼠肠道菌群结构和菌群代谢产物改变可增强大脑海马的线粒体生成和能量代谢、保护神经突触结构，从而减轻糖尿病小鼠的认知和空间记忆损伤，文章旨在研究微生物-代谢-脑轴可作为一种对抗代谢相关的认知病理生理学的治疗机制。
论文ID
题目：Gutmicrobiotamediatesintermittent-fastingalleviationofdiabetes-inducedcognitiveimpairment
译名：肠道菌群介导的间歇性禁食减轻糖尿病引起的认知损伤
期刊：NatureCommunications
IF：12.
发表时间：.2.18
通讯作者：刘学波和刘志刚
DOI号：10./s---4
主要内容
1IF抑制胰岛素抵抗和认知损伤
3个月大的db/db小鼠被给予随意饮食或者每隔28天禁食24h（Fig.1a），与同窝正常组db/m小鼠相比在db/db小鼠中食物/能量的摄取更高（Fig.1c和d），IF在不改变全部能量摄取的情况下减轻了db/db小鼠的体重（Fig.1b），在此疗法结束时IF处理大大地减少了db/db小鼠每天的摄水量和尿量。在第28天通过胰岛素耐受试验评估IF在db/db小鼠中对胰岛素抵抗的影响（图1e），与随意饮食的小鼠相比，IF处理通过抑制空腹血糖水平和空腹胰岛素水平来提高db/db小鼠的胰岛素敏感性（图1f和g），db/db小鼠经IF治疗后反映胰岛素抵抗的HOMA-IR值降低（图1h）。此外IF有意地减少了附睾白色脂肪组织（eWAT）的质量和脂肪细胞的大小。进行水迷宫测试以评估IF对糖尿病小鼠固有的认知损伤的影响，在5天的导航测试中IF降低了逃跑潜伏期，表明db/db小鼠的认知能力得到改善（图1i），在探查试验的当天IF提高了db/db小鼠在靶标象限中花费的时间，增加了糖尿病小鼠的空间记忆（图1j）。高架迷宫（一种焦虑行为测试）的结果表明IF治疗可改善db/db小鼠的焦虑行为和自主活动能力。
图一：db/db小鼠的间歇性禁食减轻了胰岛素抵抗和认知损伤。
2IF改善突触超微结构和胰岛素信号
海马区是大脑主要的与认知和记忆有关的功能区，因此检测了海马区中神经突触的超微结构，与db/db组相比，db/db-IF组小鼠突触后密度（PSD）的长度和宽度均明显增加（图2a-c）。对海马区中胰岛素信号进行评估以验证IF是否可以改善脑胰岛素抵抗，IF增加了IRS1-Tyr/IRS1和Akt的磷酸化，表明它激活了海马区中胰岛素信号通路（图2d）。还观察到与db/db小鼠相比，IF治疗增强了BDNF（一种参与维持神经元存活和突触功能的神经营养因子）的表达，并增强ERK/CREB的磷酸化（BDNF合成的上游信号）（图2e）。IF处理的小鼠的海马区中兴奋性突触后密集区中的一种支架蛋白PSD-95的表达也增加了（图2e），这与PSD超微结构的改变相一致。NFκB作为主要的介导炎症性转录因子在糖尿病小鼠的海马中被激活，IF处理抑制了NFκB的活化，并下调了JNK/p38的磷酸化和小胶质细胞活化标志物Iba-1的蛋白表达。
图二：间歇性禁食改善db/db小鼠大脑中突触超微结构，同时改变了IRS/Akt和CREB/ERK的信号传导。
3IF促进海马区线粒体的生物发生
对小鼠海马区进行RNA测序以确定海马区中IF调控的关键生物学过程和途径，采用FPKM值检测到个基因（包括个没有注释的新预测基因），其中使用差异表达基因（DEG）分析，与db/db和db/m小鼠相比，发现db/db-IF小鼠中有个基因高表达（图3a），其中大多数富含线粒体相关的GO关系分析。对在db/db小鼠中低表达的那些基因（DEG-第6组）的GO关系分析结果表明，db/db小鼠的呼吸链和线粒体裂变/翻译生物学过程是失调的，表明了糖尿病小鼠海马区中线粒体的代谢异常，然而与线粒体相关基因表达有关的调控是通过IF疗法得到了纠正（图3a）。此外经IF处理后，db/db小鼠海马区中个基因的表达（DEG-第3组和第6组）与db/m小鼠中的水平相当，甚至其中31.3％的基因比db/m小鼠中的表达量更高（60个基因）或更低（91个基因）。IF还通过上调线粒体相关基因的表达而提高了与氧化磷酸化通路有关的KEGG途径中的相关基因的表达（图3b），对这些基因的KEGG分析还表明IF处理改善了db/db小鼠中被下调的涉及氧化磷酸化中与能量代谢相关的基因表达。
为了证明被IF疗法影响的生物网络，用31个样本里的全部个基因做加权基因共表达分析并且有5大模块是被确认了在功能和生物学上都有联系的基因，“MEbown”模块与IF疗法高度正相关，这由DEG证实的个基因（88.4%）所组成，证实了49个hub基因在模块中的高度互联互通，更重要的是已证实的hub基因中的大多数是在GOterms中与线粒体代谢相关富含，并且在KEGG通路中与氧化磷酸化，亨廷顿氏舞蹈症，AD和帕金森病有关（图3C和D）与RNA测序分析结果相一致，qPCR分析证实了在db/db小鼠中表达的线粒体和代谢基因被IF上调。db/db小鼠海马区中mtDNA/nDNA比值（线粒体生物发生的指标）被IF升高（图3g），表明线粒体基因上调可能是线粒体质量增加的结果。随后检查PGC1α和AMPK/mTOR蛋白表达以揭示db/db-IF组中线粒体生物发生上调的潜在机制（图3e），IF导致线粒体生物发生的主要调节子PGC1α蛋白表达的显著增加，这与线粒体相关基因的上调建立了强烈的相关性。与先前的研究一致IF增加了AMPK（该激酶对禁食状态下细胞能量代谢敏感）的活化并抑制了mTOR（一种真核细胞营养传感器在调节线粒体质量控制和氧化磷酸化过程中起着至关重要的作用）的磷酸化（图3e）。
图三：间歇性禁食改善海马区能量代谢和线粒体生物发生。
4IF重塑肠道菌群和菌群代谢物
肠屏障的完整性对于维持肠通透性和预防内*素血症至关重要，同时还与糖尿病及其并发症相关。肠道通透性增加会增加内*素血症，从而加剧炎症并触发葡萄糖耐量受损。因此通过评估绒毛长度、肌层厚度和杯状细胞数量研究IF对肠屏障完整性的影响，结果表明IF增加了糖尿病小鼠的绒毛长度和肌层厚度，但对杯状细胞的数量没有影响。还评估了结肠的通透性，观察到IF阻止了肠泄漏并伴随血浆中LPS水平的下降，db/db-IF结肠组织肠屏障中的紧密连接蛋白claudin-1的表达也有所升高。
在第0天（基线水平）和第28天检测小鼠粪便样本中的肠道菌群组成，虽然OTU总数仍然保持在最初的相同水平上，但经过28天IF处理后α多样性显著性增加（图4a），β多样性同时也被改变（图4b）。考虑到时间作为一个影响背景，不同的饮食和鼠的基因型是肠道微生物组塑形的主要因素，分别解释了总变异的5.9％和7.7％（图4c）。IF处理并不能完全抵消糖尿病的影响，双歧杆菌的相对丰度在db/db小鼠中减少（图4d），IF处理改善了乳酸菌的丰度同时减少了肠球菌、链球菌和未知肠球菌（图4d），与db/db组相比在db/m和db/db-IF组中分节丝状菌、鲁梅尔芽胞杆菌、未知肠球菌和明串珠菌均较低（图4d）。经确定的IF相关的属与肥胖和认知相关的血糖和体重相联系，分节丝状菌与血糖呈正相关，未知肠球菌与体重呈正相关。考虑到小鼠基因类型的影响，在第28天评估了db/db组和db/db-IF组小鼠的肠道菌群组成，发现总共有17个IF影响的zOTUs，其中5个属于乳酸菌（图4e）。同时PICRUSt分析揭示了11种不同丰富的KEGG基因通路，其中在db/db-IF组中初级和次级胆汁酸的生物合成丰富（图4f）。IF处理对肠道菌群产生了巨大影响，研究它是否以及如何影响循环中的微生物代谢产物以及其水平是否主要受肠道菌群的调节是有必要的，它可以提供有关IF处理对宿主代谢有益的潜在机制的新见解。在经IF处理28天后的db/db小鼠血浆样品的非目标性代谢物谱分析结果显示许多代谢物发生了明显变化。分别从反相色谱的正极和负极采集的数据集来看，代谢物特征的数量在不同的处理方式中不同。特别强调了预先确定的、其水平主要由肠道菌群的丰富度来调节的23种微生物代谢产物的子集来证明IF处理，肠道菌群和代谢组之间的直接联系。在这些代谢产物中，与随意饮食的db/db小鼠相比，IF增加了血浆中5-羟色胺、色氨酸、对羟基苯乙酸、N-乙酰基色氨酸、肉桂酰甘氨酸、吲哚丙酸和胆汁酸的水平，例如胆酸、脱氧胆酸、鼠李酸和牛磺酸熊脱氧胆酸。相反db/db-IF组的酪氨酸、苯基乙酰基甘氨酸、苯基丙酰甘氨酸、磷酸甲酚和对甲酚硫酸盐以及12-羟基二十碳五烯酸的水平低于db/db组（图4g）。此外还分析了粪便样品中已被证明可以保护肠屏障功能和调节胰岛素敏感性的短链脂肪酸（SCFA）的浓度，经过28天的处理后IF改善db/db小鼠的乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐水平。血浆中的SCFA浓度很低，因此在当前环境中使用非目标性的代谢组学无法准确检测到。
图四：间歇性禁食治疗的db/db小鼠的肠道菌群和血浆代谢组学分析。
5IF方案的多组学综合分析
在确定了IF在糖尿病小鼠中上调或下调的不同组学特征后，接下来评估海马区基因表达（图3）、肠道菌群组成（图4）和微生物代谢产物（图4）之间的相互作用与IF处理对小鼠认知缺陷观察到的影响相联系（图2）。多组学数据集是用一个潜在元件方法（DIABLO），整合使用数据对生物标志物的挖掘做综合性分析，DIABLO是一种旨在从各种组学技术中识别出生物学相关和高度相关的特征的多元降维判别分析方法（图5）。在进行多O组学整合之前首先评估了IF上调的hub基因（n=36），IF改变的OTUs（n=17），预先确定的血浆微生物代谢产物（n=23）和3个粪便SCFAs（乙酸盐，丁酸盐和丙酸盐）可以在一个多变量的方式上预测小鼠的IF状态。在db/db和db/db-IF小鼠之间实现了显著分离，hub基因，OTUs和代谢物的预测准确度分别为％，90％和95％（图5a）。综合模型是在多组学特征和一个包含来自于每个组学数据集的10个关键预测因子的潜在成分中所进行的，这造成了db/db和db/db-IF之间的巨大间隔（图5b）。最佳选择的关键预测因子包括几种肠道菌群（即乳酸菌、拟杆菌和费克蓝姆菌），微生物代谢物（如胆汁酸、吲哚丙酸、5-羟色胺、色氨酸、羟基色酚和硫酸吲哚酚），以及富含线粒体、核糖体的基因或与代谢相关的GO分析（图5b和c），关键预测因子也是高度相关的（图5d）。
图五：IF处理相关的多组学集成建模策略和性能。
6肠道菌群是IF的有益作用所必须的
为了证明肠道菌群在介导固有糖尿病认知缺陷中的关键作用，检查观察到的IF有益作用在db/db小鼠中去除肠道菌群后是否会受到影响。在4周IF疗法之前的14天以及整个实验中在小鼠饮用水中使用抗生素，并在28天后评估行为改变。抗生素处理削弱了IF处理的减肥效果（图6a），抗生素处理对eWAT的重量没有影响但会增加肝脏和盲肠的重量，IF和抗生素处理都减少了db/db小鼠的摄食量和摄水量，但是口服抗生素对IF在胰岛素抵抗的有益作用上没有影响。通过水迷宫测试发现与IF相关的认知能力的改善在经抗生素处理后被部分抵消。在db/db-IF小鼠中抗生素处理废除了线粒体生物发生的上调（图6c），抗生素处理使db/db-IF小鼠PSD宽度减小（图6d和e）。这些结果共同表明肠道菌群的移除部分地废除了IF对认知功能的保护作用。另外与db/db-IF组相比，通过抗生素处理移除肠道菌群可显著降低db/db小鼠血浆中吲哚丙酸的水平和粪便中SCFAs水平。
图六：抗生素和微生物代谢产物对经IF处理的db/db小鼠认知功能的影响。
7微生物代谢产物改善认知功能
进行了另一项动物实验以研究IF在调节肠道菌群代谢产物，特别是在抗生素治疗组中降低的吲哚丙酸和SCFAs在改善认知缺陷中的作用,还研究了神经末梢5-羟色胺和牛磺酸熊脱氧胆酸(IF组中升高)对认知功能的影响。在db/db小鼠中分别口服这些代谢物均可改善认知功能和胰岛素敏感性（图6g），口服这些代谢物还能够增强线粒体生物发生并保护突触超微结构（图6h–j）,此外牛磺酸熊脱氧胆酸处理可抑制db/db小鼠体重增加（图6f），但其他测试的代谢物不能。所有代谢物处理对db/db小鼠的摄食量和摄水量都没有影响。
总结
当前的研究表明在IF治疗后的糖尿病小鼠中，肠道菌群可通过肠道菌群代谢产物与认知功能之间建立新颖而令人信服的联系。IF治疗可重塑肠道菌群并改变肠道菌群代谢产物，上调海马区线粒体生物发生和能量代谢，保护突触超微结构，并减轻认知和空间记忆损伤。IF对菌群/代谢物/基因变化的影响应该在临床试验中进一步评估,一旦通过验证，IF便可作为用于控制代谢性和神经退行性疾病的新型生态方法。
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